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    分享PIERCE超敏型發(fā)光液的使用及注意事項
    瀏覽次數(shù):2314發(fā)布日期:2022-03-26
      PIERCE超敏型發(fā)光液直接或間接檢測與辣根過氧化物酶HRP關(guān)聯(lián)的蛋白或核酸底物。這一*的發(fā)光底物系統(tǒng)是目前靈敏的商業(yè)化熒光ECL檢測試劑,具有*靈敏度和高信噪比,可檢測出10-100fg的微量抗原;發(fā)光迅速,熒光可使X感光膠片感光達(dá)12小時以上,特別適用于痕量蛋白或核酸檢測。同時該試劑允許使用更高的抗體稀釋倍數(shù),極其節(jié)省抗體。
     
      PIERCE超敏型發(fā)光液的使用
     
      1.常規(guī)電泳、跨膜、HRP標(biāo)記抗體或核酸探針培養(yǎng)和膜清洗。應(yīng)注意用HRP或夾心法標(biāo)記免疫球蛋白。將核酸雜交膜與HRP標(biāo)記探針雜交并清洗。
     
      2.在清洗膜上用HRP標(biāo)記第二抗體的同時,新鮮制備工作液:將相同體積的A和B分別混合,置于室溫下,恢復(fù)熒光強(qiáng)度,否則熒光強(qiáng)度會減弱。建議立即使用工作液。它在室溫下幾小時后仍可以使用,但靈敏度略有降低。
     
      3.用鑷子把膜取出,放在濾紙上,把乳液排出,但不要使膜*干燥。將薄膜*浸入并與發(fā)光工作液(約0.125 ml發(fā)光工作液/cm2薄膜)*接觸。在室溫下孵育3分鐘后,立即將薄膜壓平并曝光。長孵育時間不會增加敏感性,有時會導(dǎo)致異常暴露帶。發(fā)光過程的本質(zhì)是酶促反應(yīng)。發(fā)光工作液太少不利于反應(yīng),也會導(dǎo)致薄膜上條帶曝光不均勻,靈敏度大大降低。為了省錢,可以減少薄膜的用量,但不應(yīng)減少發(fā)光液的用量。
     
      4.用鑷子拿起薄膜,放在濾紙上,放出發(fā)光工作液。但不要把光亮沖走。
     
      5.將面積大于膠片的保鮮膜放在X射線膠片盒內(nèi)部。混合膜貼在保鮮膜上。混合膠卷被折疊起來并*包裹起來。去除氣泡和皺紋,并可切斷邊緣多余的保鮮膜。用濾紙吸收多余的熒光工作液。將覆蓋混合膜的保鮮膜用膠帶固定在暗盒中,推薦的蛋白帶朝上。
     
      6.把X光膠片放在黑暗中,曝光時間不同,比如幾秒到幾分鐘。沖洗顯影液。
     
      PIERCE超敏型發(fā)光液注意事項:
     
      1.步驟1-5可以在熒光燈下操作,但在強(qiáng)光照射時間過長時,發(fā)光液體的靈敏度可能會略有降低,因此可以避免移動到暗室。戴手套可以避免在膜上留下指紋,保持膜的清潔。
     
      2..長期暴露或蛋白質(zhì)過量會加深背景,使帶強(qiáng)度變化失去線性關(guān)系。曝光不足會使波段變模糊。
     
      3.膜上的帶在孵育3分鐘后會發(fā)光。暗室中肉眼可見強(qiáng)條帶,而低豐度蛋白條帶則較弱。雖然肉眼看不見,但它們可以曝光X光片。光波段的發(fā)光時間不能單獨用肉眼觀察來判斷。不可見熒光實際上持續(xù)數(shù)小時,使X射線膠片感光,因此弱帶可以暴露1-10小時。如果暴露后條帶不好,可使用洗滌緩沖液清洗膜,再次出現(xiàn)第二抗體,然后重新使用ECL燈和暴露。
     
      4、由于PIERCE超敏型發(fā)光液的高靈敏度,強(qiáng)烈推薦大多數(shù)進(jìn)口抗體起始濃度為一抗1:1000-1:4000,二抗1:2000-1:5000。抗體濃度過高將造成高背景或沒有條帶,導(dǎo)致失敗!
     
      5.一些商業(yè)保鮮膜封裝的壓印膜將熄滅熒光。選用優(yōu)質(zhì)保鮮膜,如“克林來”牌保鮮膜。
     
      6.使用可見的預(yù)染色蛋白標(biāo)記和熒光放射自顯影曝光標(biāo)簽可以幫助確定膠片上條帶的確切位置和尺寸。
     
      7.NaN3能抑制HRP的活性。第二種抗體回收后應(yīng)避免使用NaN3。如有必要,不得超過0.01%。
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