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    如何提取膜蛋白
    瀏覽次數:7304發布日期:2012-06-12

     

    I. n-Octyl-β-D-glucoside提取大腸桿菌乳糖輸送體

    1. 試劑

    ·lacY recombinant大腸桿菌T206制備的膜泡

    ·n-Octyl-β-D-glucoside

    ·膽酸鈉 (Sodium cholate)

    ·Dithiothreitol (DTT)

    ·取自大腸桿菌的磷脂 (Avanti Biochem.公司

    ·DEAE-Sepharose CL-6B (GE Healthcare公司

    ·磷酸鉀 (Potassium Phosphate)

    ·乳糖 (lactose)

    ·尿素生化級

    ·磷酸

    2. 方法

    以下操作,在沒有特指時的溫度是指4℃,用Vortex mixer攪拌。

    1) 要得到約10 mg的蛋白質,可以取外翻型膜泡 (inside-out vesicles) 12.5 mg,加入1 ml緩沖液 (50 mmol/l 磷酸鉀,pH7.50.5 mmol/l DTT10 mmol/l乳糖)制成懸濁液。

    2) 在室溫條件下,邊攪拌,邊滴加等量的尿素溶液(10 mmol/l)

    3) 在冰浴中放置10分鐘后,在175,000× 的速度條件下離心1小時。

    4) 沉淀用1.75 ml緩沖液 (50 mmol/l磷酸鉀,pH7.5) 制成懸濁液。邊攪拌,邊加入膽酸鈉溶液 (20%w/vpH7.8),終濃度為6%

    5) 在冰浴中放置20分鐘后,在26,000×g的速度條件下離心15分鐘。

    * 以上操作是為了去除膜中不需要的蛋白質。

    6) 沉淀用5 ml緩沖液 (10 mmol/l磷酸鉀,pH5.8) 制成懸濁液,離心,重復此步驟1-2次。

    7) 沉淀用1.45 ml緩沖液 (10 mmol/磷酸鉀,pH5.8) 制成懸濁液,加入17.5 l DTT溶液 (100 mmol/l)13 mg乳糖,131 l磷脂溶液 (50 mg/ml),攪拌均勻。

    8) 在上述溶液中加入146 µl n-Octyl-β-D-glucoside (15% w/v10 mmol/l磷酸鉀,pH5.8),使終濃度為1.25%

    蛋白質/磷脂/去垢劑的比例約為1:3:10

    9) 攪拌時請注意不要起泡沫,在冰浴中放置10分鐘后攪拌,然后在175,000× 的速度下離心1小時。

    10) 取上清,用磷酸溶液 (10 mmol/l 磷酸, 1.25% n-Octyl-β-D-glucoside) 調節pH5.8

    11) DEAE-Sepharose 純化柱純化1 ml蛋白質提取液含約300 µg 蛋白質

    溶出液:10 mmol/l 磷酸鉀,pH5.81 mmol/l DTT20 mmol/l乳糖, 0.25 mg 磷脂/ml, 1.25%(w/v) n-Octyl-β-D-glucoside

    II. n-Heptyl-β-D-thioglucoside提取腸炎弧菌的膜結合性 5'-核苷酸酶

    1. 試劑

    ·采用French Pressure法制備的膜泡

    ·n-Heptyl-β-D-thioglucoside

    ·EDTA-2K

    ·Dithiothreitol (DTT)

    ·Tricine

    ·MOPS

    ·Tris

    ·氯化鈉

    ·硫酸鎂

    ·2-Mercaptoethanol

    ·DEAE-Sepharose CL-6B (GE Healthcare公司

    2. 方法

    以下操作,在沒有特指時的溫度是指4℃。

    1) 取腸炎弧菌的的膜泡145 mg蛋白質30 ml緩沖液(3 mmol/l Tricine-TrispH8.00.5 mmol/l EDTA-2K1 mmol/l 2-Mercaptoethanol) 制成懸濁液。在冰浴中輕輕地攪拌約30分鐘后,105,000×g離心1小時。

    2) 加入含有n-Heptyl-β-D-thioglucoside 40 mmol/l的緩沖液(20 mmol/l MOPS-TrispH7.55 mmol/l硫酸鎂、1 mmol/l DTT) 制成懸濁液,蛋白質濃度約為1 mg/ml。在冰浴中輕輕地搖勻約15分鐘。

    3) 105,000×g離心1小時,得到5'-核苷酸酶的上清。

    4) DEAE-Sepharose 純化柱純化上清。溶出液:50 mmol/l MOPS-TrispH 8.05 mmol/l硫酸鎂、1 mmol/l DTT40 mmol/l n-Heptyl-β-D-thioglucoside100→400 mmol/l (梯度氯化鈉

    III. CHAPS提取巨噬細胞的細胞骨架

    1.試劑

    ·S.typhimurium LPS (Difco公司

    ·胎牛血清 (FBS)

    ·肝素 (heparin)

    ·Dulbecco's MEM (DMEM)

    ·Plasticcoverslip (SUMITOMO BAKELITE 公司、celldesk)

    ·PIPES

    ·HEPES

    ·GEDTA

    ·Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMASigma公司

    ·氯化鎂

    ·CHAPS (在硅膠干燥器中干燥約2周后使用

    2. 方法

    1) 用滅菌蒸餾水將 S.typhimurium LPS配制成200 µg/ml。給小鼠 (SLC-ICR7-10周齡腹腔注射,劑量為0.25 ml/只。

    2) 5-6天后,用10 mmol/l HEPES(添加10% FBS10 U/ml肝素、含DMEM pH7.1)洗凈腹腔,收集細胞。

    3) 4DMEM將貼壁的腹腔細胞離心洗凈3 (1,000 rpm10分鐘/

    4) 用含有10% FBSDMEM調節細胞濃度至10e6/ml,移至培養皿中。

    5) 4的條件下,用FBS浸泡蓋玻片一個晚上,然后用DMEM洗凈10分鐘,將蓋玻片放入上述培養皿中。在CO2培養箱中37下孵育20分鐘每一張蓋玻片需要細胞液1 ml)

    6) 將蓋玻片一張一張放入4含有DMEM的培養皿中,用巴氏吸管吸掉非貼壁細胞。

    7) 在含有10% FBSDMEM中加入稀釋的PMA,在CO2培養箱中37下孵育20分鐘。

    8) 用室溫DMEM將貼付著細胞的蓋玻片洗凈10分鐘。

    9) 用室溫的PHEM 緩沖液 (60 mmol/l PIPES25 mmol/l HEPES10 mmol/l GEDTA2 mmol/l氯化鎂、pH6.9)

    清洗2 (10分鐘/

    10) 預先將蓋玻片放置在37PHEM緩沖液中約5分鐘。

    11) PHEM緩沖液配制0.5%CHAPS溶液*2,*3,取15 ml加入*4直徑為6 cm的培養皿中,將蓋子反過來蓋在培養皿上,放置在37培養箱中。

    將貼付著細胞的蓋玻片放在如上的培養皿中(2張蓋玻片/1個培養皿,放置3分鐘后會露出細胞骨架,這時輕輕振搖培養皿45-60秒。

    12) 37PHEM 緩沖液洗凈3分別為2-3分鐘,10分鐘,10分鐘,清洗后放回到室溫的PHEM 緩沖液里,細胞骨架樣品制備完成。

    *1 清洗不足的話,會降低細胞骨架露出率。

    *2 CHAPS溶液要在使用前1小時內配制,混合時注意不要產生泡沫。CHAPS的濃度一定要準確地配制成0.5% (8.132 mmol/l )。如果濃度過高,會增加從蓋玻片上掉落的細胞,一部分的細胞骨架會溶解下來。如果濃度過低,會導致細胞膜的溶解效果差。

    *3 CHAPS的溶液量,1個直徑13.5 mm的培養皿需要6 ml以上。

    *4 請注意振搖過強的話,會增加細胞脫落。

    IV. CHAPS從原生質體分離液胞

    1. 試劑

    ·Atriplex gmelini的綠葉中制得的原生質體 (1.2 mol/l山梨糖醇中分離

    ·CHAPS

    ·GEDTA (EGTA)

    ·HEPES

    ·山梨糖醇

    ·Tris

    2.方法

    1) 1 ml 原生質體放入巴氏瓶中*1

    2) 加入50 ml緩沖液 (1.0 mol/l山梨糖醇、1 mmol/l GEDTA0.5 mmol/l CHAPS20 mmol/l HEPES-TrispH8.0)120×g離心3分鐘。

    3) 收集上清液中的液胞1.2 ml)*2,放入巴氏瓶中。

    4) 用緩沖液 (1.0 mol/l 山梨糖醇、20 mmol/l HEPES-TrispH8.0) 稀釋19倍。120×g離心3分鐘, 回收上清液中懸浮的液胞。

    *1 0.5 mol/l 山梨糖醇分離原生質體時,添加10% Ficoll 400等,使原生質體懸浮。

    *2 原生質體的上清液不濃縮的話, 使用Ficoll 400等,需要提高溶液的比重。

     

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